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技术大咖秀|“单抗药物纯化工艺探索与开发”Q&A精彩回顾
点击次数:2664 发布时间:2015-10-20

十一长假结束,小编正式回归。zui近新闻也是目不暇接,前有国人屠呦呦获诺贝尔生理学和医学奖,后有AB教主的世纪婚礼。为了让还在倒时差的各位亲们能更好 的跟上时代的新步伐,小编特意整理了哥家9月 24日下午19:15 ~21:00由资深技术专家带来的“单克隆抗体药物纯化工艺探索与开发"精彩Q&A回顾。错过的亲们,让我们一起再次感受知识的力量吧!

1干货回答 让您分分钟了解抗体纯化工艺

什么是反压、压力降?

答疑解惑

了解基本名词术语"

反压是层析过程中,泵产生流速,流速作用层析柱产生的压力。如下图所示:

层析柱的反压以及压力降
图为?KTA Avant 的压力显示

0。5MPa 为层析柱的反压,压力降为0。3MPa

层析柱产生反压:主要是层析介质,层析柱的设计,层析柱筛板等。真正影响层析介质的为压力降,压力降高于层析介质的耐压,层析介质会损坏。

层析填料入厂检验做哪些比较合适?

答疑解惑

填料检验多重标准"

原料入厂GMP要求做检测,合格才能进厂使用。一般有几种方法:

审计供应商

做供应商审计是否复合ISO等要求,确认此供应商符合我项目要求,所以可以免检。

自己检测

此需要在工艺开发中做层析介质重要参数对产品质量的确定。(例如:层析介质的颗粒在XX-XXum时,产品的质量才能到达要求,并且供应商的产品不同批次 的颗粒有较大差别,所以确定颗粒为比检项目)。对于这个问题,国外药厂一般在工艺开发时,至少做3批不同批号的层析介质实验以确定供应商出厂指标范围内可 以满足要求。

Protein A和Protein G两种介质在纯化抗体有何区别,结合位点各有几个?

答疑解惑

Protin A和G的区别结合位点"?

Protein G 的结合位点
Protein G与Ig G的Fc结合,同时也可以结合IgG CH1区域。此配基为 17KD, PI 4.1. 在全抗体或Fc融合蛋白的纯化中由于Protein A 层析介质的载量高于Protein G,所以一般使用Protein A层析介质。
Protein A 的结合位点
与IgG结合的亚类主要是IgG1、IgG2和IgG4。
Protein A与抗体IgG 结合区域

Protein A与抗体IgG 结合有两个区域,Fc 与Fab。主要与Fc的CH2,CH3 结合的是Protein A 的B,与Fab 结合位点是VH3

各环节中浓缩和换液采用膜包还是中空纤维,二者有什么区别?

答疑解惑

用途区别"

中空纤维

中空纤维一般用于样品中含有沉淀、浑浊、颗粒等,以及低剪切力的样品
膜包
膜包用于样品比较干净的样品

在工艺中区别"

中空纤维

用于低剪切力的病毒浓缩;固液分离;澄清;以及包涵体复性等
膜包
用于缓冲液更换,浓缩等

2、速问速答小问题大门道,好知识速速来袭

层析除病毒验证,

需要做旧胶的验证吗?

答疑解惑

关于病毒验证是否需要做旧胶还没有听到法规的要求。新药报批时一般要求工艺验证,在工艺验证中会涉及层析介质的寿命。层析介质寿命的确定是有效去除杂质达到质量要求。亲和层析/离子交换介质已经有文章证明Protein A在寿命内有完全满足病毒去除。

非糖基化的抗体

采用什么技术来去除?

答疑解惑

非糖基化的抗体一般是抗体片段(CHO表达的为有糖基),抗体片段一般使用Protein L吸附Fab

阴离子交换低电导较好,但zui近做了DOE,

发现电导11比较好,何解?

答疑解惑

阴离子交换一般采用流穿模式(FT),所以需要一定的电导率让抗体(单体)流穿,其他杂质吸附。不同的样品还是以实验为准


能否介绍一些FC-肽融合蛋白的精细纯化方法?

答疑解惑

FC-融合蛋白的的精细纯化一般采用阴/阳离子交换。也有使用HIC,或羟基磷灰石的纯化。还要根据样品做DOE。

柱高不变,直径由1.6cm放大到比如20cm,柱压会增大多少?

答疑解惑

层析放大的原理为直径放大,柱高不变(即线性流速或保留时间不变)。在放大时层析柱的分配器,以及筛板设计非常重要。设计优异的柱压一般不会增大。


工艺验证中需要确定CQA,CPP,可以针对一个层析方法说明一下确认的方法吗?

答疑解惑


首 先确定不同步骤主要去除杂质以及去除杂质能力,例如阳离子去除聚体步骤,经过此步骤聚体可以从2%降至0.3%。经过DOE实验确定,CPP: 为上样量(xx-xxmg/ml),样品电导率(~~),洗脱时的电导率范围。在以上的条件下可以满足CQA(0.3%以下)聚体的要求。

阴离子流穿模式,说的载量指的是目的蛋白载量?VH一个domain的纯化可以用Protein A亲和吗?

答疑解惑

阴离子流穿模式(FT)的载量指的是抗体的量。一般在上样是抗体流穿,检测纯度,HCP等,至超标时上样的抗体的量为载量

Protein A (重组的,非修饰的)与VH3结合

3、案例分享 ?用实验中的真实案例答疑解惑

有没有关于酸碱异构体组分降低的案例分享?

答疑解惑

对于酸碱异构体的分离一般比较困难,因为差异较小。在GE的应用文献中有使用Capto S ImpAct分离的。一般使用阳离子交换(颗粒小的30-40um),做线性梯度洗脱。也可以在DOE时设计盐梯度与改变pH同时的洗脱策略。

现在我做的抗体,proteinA 捕获时只要载量高就会出现浑浊,低载量澄清?

答疑解惑

Protein A的层析介质
一般Protein A的层析介质载量在30-50g/l,洗脱时可以达到10-20mg/ml浓度,工程抗体的溶解度较高,一般较少出现沉淀。但是有时洗脱时由于HCP没有去除干净,洗脱液中会有沉淀,过夜或低pH后更明显
建议
检测抗体的溶解度,检测洗脱的HCP的量

此步骤可以使用低pH(pH在5-6,要实验),加入一些盐或低浓度尿素等

宿主DNA和宿主蛋白是否是同步去除的,宿主DNA如何更好去除?

答疑解惑

DNA/HCP一般会同步去除,只是不同步骤去除的量稍有不同。 对于DNA的去除,亲和/阳离子交换/HIC不吸附,阴离子交换吸附。只有实验才能确定您的项目哪种zui好。

抗体的等电点能否用生物信息学的方法预测,消光系数怎么计算?

答疑解惑

一般预测的软件得到的一些参数不是很准确,不同的表达系统,不同的培养方法,所得到的等电点不同。所以只能参考。

消光系数的公式
A=ECL,E消光系数,C浓度,L光径。zui好使用纯的抗体样品标定消光系数。
小技巧

使用1mlHitrap MabSelect Sure纯化收集洗脱样品,使用Lowry或Bradford标定消光系数。在之后的工艺探索中可以简单的使用紫外吸收值定量。

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