上海必泰生物科技北京赛车

联系我们

上海必泰生物科技北京赛车
联系人:刘小姐
电话:021-58358157
手机:18621924707
传真:
网址:guinve.com
E-mail: bestestbio@126.com
邮编:200072
地址:上海市浦东新区三旋路506弄13号

whatman 3MM滤纸的应用
点击次数:728 发布时间:2017-03-14

whatman 3MM滤纸的应用---杂交筛选——cDNA序列作为探针

1.如上述将文库铺平板,噬菌斑杂交实验用E.coli宿主菌株Y1088。

2.噬菌斑于42℃生长过夜。

3.从温箱取出平板,置4℃冷却至少1h。

4.膜剥离:首先,用软铅笔在干的硝酸纤维素滤膜上给准备影印的平板编号。其次,从平板的中央开始向边缘小心将滤膜铺在菌台上。当滤膜完全变湿后(颜色变灰),再等30s。同时,用针头在平板上标出滤膜的3个不对称位置。小心将滤膜从平板上剥离,接触面向上放在一张干净的Whatman 3MM滤纸上。在进行下一步骤之前,所有的平板重复步骤4。

5.将滤膜接触面向上漂浮在变性液(0.5 mol/L NaOH; 1.5 mol/LNaCl)中5min。

6.中和5min。

7.用2×SSC洗涤5min。

8.将滤膜放在一张新的Whatman3MM滤纸上,用铅箔将滤膜和滤纸一起包住。

9.在真空炉中80℃烘烤2h。

10.用6×SSC预先短暂地湿润滤膜,然后用预洗液(50 mmol/LTris-Cl pH8。0; 1mol/L NaCl; 1mmol/L EDTA; 0。1%SDS)于68℃预洗涤至少1h。用一个盘子放在水浴摇床上。

11.将25张滤膜转移到一个装有50ml杂交液(5×SSPE;1×Denhardt's液;100μg/ml cT-DNA;0.1%SDS)的贮存罐内(直径至少90mm),68℃预杂交2h。

12.对于每ml杂交液,2倍的105至1×106cpm的双链探针经沸水浴变性10min后,迅速放冰上冷却。

13.变性探针立即加到预杂交混合液中。

14.在封口的贮存罐内于68℃杂交过夜,不断地晃动以防滤膜粘在一起。

15.杂交结束后,滤膜用2×SSC,0。01%SDS于室温洗涤3次约1h。

16.将潮湿(防止干燥)的硝酸纤维素滤膜放在一张硬纸或X光片上,用放射性墨水在针头标签上作标记。

17.滤膜用塑料包装袋(如Saran)包住,然后加上增感屏在X光片上于-70℃曝光过夜。

上海必泰生物科技北京赛车 版权所有 地址:上海市浦东新区三旋路506弄13号 邮编:200072 电话:021-58358157
传真: 手机:18621924707 联系人:刘小姐 邮箱:bestestbio@126.com  GoogleSitemap 网址:guinve.com ICP备案号:
主营:whatman沃特曼、pall颇尔、millipore密理博等品牌实验耗材及仪器
客服2
秒速时时彩计划 福利彩票北京赛车 秒速时时彩 秒速时时彩官网 北京赛车开奖走势图 北京赛车网站 秒速时时彩首页 秒速时时彩官网 秒速时时彩官网 北京赛车开奖走势图